Prepararea culturilor de fibroblaste


Pentru prepararea fibroblastelor din embrioni de pasare se folosesc embrioni intre a 9-a si a 13 –a zi de
incubatie.
Recoltarea tesuturilor destinate culturilor celulare primare trebuie sa respecte urmatoarele principii:
Sa se asigure conditii de asepsie cat mai riguroase – recoltarea sa se faca in recipiente si cu instrumente
sterilizate, evitandu-se folosirea substantelor antiseptice.
Tesutul recoltat sa fie cat mai putin traumatizat
Recoltarea sa se faca cat mai curand dupa sacrificare pentru  ca viabilitatea tesutului recoltat sa nu aiba de
suferit.
Timpul scurs intre recoltarea si prelucrarea celulelor sa nu depaseasca 3-4 ore.

ETAPE –obtinerea culturii primare de fibroblaste.

1.        Suspendarea embrionului de 9-11 zile in alcool timp de 5 minute  - nedeschis.
2.        Scoaterea si taierea in zona camerei de aer – cu instrumente sterile Se trage membrana cu pensa si
se prinde usor, evitand spargerea vitelusului.
3.        Se scoate embrionul intr-un vas Petri steril si se indeparteaza aripi, picioare, cap si organe.
4.        Se ia tesutul si se suspenda in PBS (solutie salina tamponata – Phosfat buffered solution) pe
agitator magnetic – 1 parte tesut la 4 parti PBS timp de 5 minute. In flaconul Erlenmayer se adauga un
magnet pentru omogenizarea permanenta a suspensiei.
5.        Se elimina PBS – si se adauga tripsina – pentru dizolvarea chitului intercelular; 10 minute pe agitator.
6.        Se strecoara suspensia prin tifon.
7.        Se repune pe agitator cu alta cantitate de tripsina  - 15 minute la turatie moderata.
8.        Cand nu se mai observa fragmente de tesut – tripsinizarea se considera incheiata cand majoritatea
fragmentelor au un aspect albicios zdrentuit. Se adauga ser fetal bovin 15 %.
9.        Se centrifugheaza la 1000 t/min 10 minute – mai mult se sparg celulele.
10.        Se elimina tripsina si ramane depozitul celular – si se adauga 2-3 ml  ser si 2-3 ml mediu ( Mediul
199) si se pipeteza puternic – si repede deoarece celulele pot agrega intre ele – se fac cam 30 de suflari.
11.        Se pune suspensia obtinuta ( celule –tripsina-mediu- ser) si 10ml ser – si se completeaza cu 100
ml mediu.
12.        Este necesara o concentratie de 3-4 x 105 celule/ml mediu
13.        Pentru a stabili densitatea suspensiei se face o apreciere cu ochiul liber sau se face o numaratoare
– 1 ml suspensie si 1 ml tripan bleu si se pune in camera Thoma sau Turck sau Fuchs –Rosental. Prin
colorare se face o diferentiere intre celulele vii si moarte. Se face media a 3 numarartori. Celulele apar ca
puncte luminoase.

14.        Dupa stabilirea numarului de celule si prepararea concentratiei optime de celule se trece la
repartizarea in placi – 200ml/placa mare si 15 ml pe colita.

15.        Se incubeaza 24 ore la 37 ºC.
16.        Pe partea superioara a tubului  se face un semn.
17.        Avand asigurate conditii optime , fiecare celula sau grup de celule  constituie un mediu de
multiplicare, un punct de plecare de la care prin diviziunea celulara repetatata se obtine un monostrat
uniform, o pajiste sau covor de celule in care abia se mai disting nucleele intitale.

Este necesra o improspatare a mediului nutritiv. Meticulozitatea efectuarii operatiunilor de pregatire a
culturilor si calitatea mediilor sunt primordiale pentru obtinere de culturi de calitate.
Neglijarea unor aspecte cum ar fi calitatea apei sau a sticlariei poate compromite reusita intregii tehnologii.
Mediile sunt astfel constituite sa asigure echilibrul osmotic – schimb normal de ioni intre celula si mediu
Culturi celulare primare
Google
ABIS  online
BACTERIAL IDENTIFICATION
SOFTWARE
Inapoi
Acasa
Previous page