ABIS 6 online
IDENTIFY BACTERIA
Cuvinte cheie: hemocite, cultivare “in vitro”, larve de albină meliferă

Rezumat. S-a urmărit obţinerea de culturi primare de hemocite ale albinei melifere, Apis mellifera L., şi evaluarea unor
parametri şi a condiţiilor de cultivare. S-a lucrat cu hemolimfă extrasă de la larve de diferite vârste (4 – 7 zile) de albină
lucrătoare. Caracterizarea morfologică a fost făcută prin examenul direct cu microscop optic ranversat şi prin coloraţia
Giemsa, iar viabilitatea hemocitelor a fost evaluată procentual prin tehnica de excludere vitală cu o soluţie 0,5% trypan
blue. Examinările au fost efectuate din două în două zile, începând cu a 5-a zi de cultură până la 14 zile, pentru culturile
obţinute de la larve în vârstă de 4 – 5 zile şi la 14, 18 şi 21 zile de cultivare pentru culturile obţinute de la larve în vârstă
de 6 – 7 zile. Au fost caracterizate morfologic şi identificate atât hemocitele (granulocite + oenocitoide) cât şi celulele
din fragmentele de corp gras (celule grase şi oenocite) şi a fost apreciată viabilitatea granulocitelor + oenocitoide
pentru intervalul 5 – 21 zile de menţinere a celulelor în cultură.



Introducere. Există un număr foarte redus de lucrări privind cultivarea “in vitro” a celulelor şi ţesuturilor de albină
meliferă, Apis mellifera L. În 1968, Stanley (5) şi în 1971, Giauffret (1), au comunicat obţinerea de culturi primare de
ţesut ovarian de pupe de regină pentru ca, în 1988, van Steenkiste (7) să comunice obţinerea de culturi primare de
hemocite.
Cultivarea “in vitro” a hemocitelor este utilă pentru studiul mecanismelor celulare ale imunităţii albinelor (7). În acest
sens, mai întâi trebuie apreciată posibilitatea de a obţine culturi primare de hemocite, apoi de stabilit parametrii şi
condiţiile de supravieţuire a hemocitelor în cultură, urmate de încercări de stabilizare a culturii primare (deci obţinerea
unei linii hemocitare) pentru ca, astfel, să se creeze un important mijloc de studiu atât al fagocitozei şi formării de
noduli cât şi a inducerii sintezei proteinelor imune.
În acest scop, s-a urmărit obţinerea de culturi primare de hemocite şi evaluarea unor parametri (morfologie, densitate,
viabilitate, prezenţa altor tipuri celulare) şi a condiţiilor de cultivare.

Material şi metodă
a) Insecte
Dintr-o familie sănătoasă de albine au fost recoltate fragmente de fagure cu larve de lucrătoare de diferite vârste (lotul
VI). În aceiaşi zi a fost prelucrată o parte din larvele în vârstă de 4-5 zile (L4-5). Celelalte fragmente de fagure au fost
menţinute 48 h la 300C, prelucrându-se larvele ajunse la vârsta de 6-7 zile (L6-7).
b) Cultivarea “in vitro” a hemocitelor
Protocolul de lucru este o adaptare după Van Steenkiste (7), şi Giauffret (1). Larvele au fost decontaminate prin
imersie 1 minut în alcool etilic 70% şi într-o soluţie de antibiotice(Penicilină 500 UI/ml, Streptomicină 500 g/ml şi
Amfotericină B 2,5 g/ml) în MEM (Eagle) (Gibco-BRL) 30 secunde şi uscate pe hârtie de filtru. Extragerea hemolimfei
s-a făcut cu pipete Pasteur din vasul dorsal, dintre segmentele abdominale VIII-IX, unde diametrul vasului este maxim
(Nelson, 1924, citat de 1).
Culturile au fost efectuate în plăci de plastic LINBRO (Flow Laboratories) cu 24 godeuri. În fiecare godeu s-au
repartizat câte 300 l mediu Grace (Sigma) pH 6,5 suplimentat cu 4% hidrolizat de lactalbumină (Sigma), 5% ser fetal
bovin (Sigma) şi antibiotice (Penicilină 50 UI/ml şi Streptomicină, 50 g/ml), adăugându-se hemolimfa extrasă de la 1-
2 larve. În plus, întrucât de la unele larve s-a extras hemolimfă care conţinea şi mici fragmente de corp gras, a fost
necesară separarea godeurilor cu cultură în două categorii: cu hemolimfă (H) şi cu hemolimfă + fragmente de corp
gras (H+CG).
După 15-45 minute s-au înlocuit 250 l mediu din fiecare godeu cu câte 950 l, în final volumul culturii fiind de 1000
l. Lucrările au fost efectuate la o hotă sterilă cu flux de aer orizontal. Plăcile au fost lipite cu bandă adezivă, introduse,
împreună cu o bucată de şerveţel umed, într-o pungă de plastic (6) şi incubate la o temperatură iniţială de 25,50C  şi
finală de 28,50C în atmosferă normală.
c) Aprecierea parametrilor culturii
Caracterizarea morfologică a fost făcută prin examenul direct cu un microscop optic ranversat (30x, 100x, 200x),
utilizând şi un micrometru ocular, şi prin coloraţia Giemsa modificată (4) a preparatelor efectuate cu suspensie
celulară extrasă din godeuri.
Viabilitatea hemocitelor (GR+OE) a fost evaluată procentual prin tehnica de excludere vitală cu o soluţie 0,5% trypan
blue (6; Yip şi Anersperg, 1972, citaţi de 7). Aprecierea viabilităţii s-a făcut atât în godeuri H cât şi în godeuri H+CG.
Aceste examinări au fost efectuate din două în două zile, începând cu a 5-a zi de cultură şi până la 14 zile, pentru
culturile obţinute de la L4-5, şi la 11, 18 şi 21 zile de cultivare pentru culturile obţinute de la L6-7.

Rezultate şi discuţii
La o oră de la cultivare, prin examinare directă la microscop, s-au observat numeroase celule rotunde, mici (10-17 m
diametru), cu citoplasma heterocromă, strălucitoare, şi rare celule alungite, poliforme, aderente de fundul godeului
(celule fibroblast-like). În godeurile H+CG au fost observate şi celule mari (40-70 m diametru), cu aspect muriform,
opace precum şi rare celule cu dimensiuni intermediare (20-30 m diametru), ambele categorii fiind sferice.
La 48 ore de la cultivare, în godeurile H se observă scăderea numărului de celule fibroblast-like (fig. 2, 3, 5), marea
majoritate a celulelor fiind reprezentată de cele mici, sferice, care prezintă heterocromie accentuată (granule sau
vezicule citoplasmatice) şi membrana citoplasmatică evidentă. Granulele/veziculele citoplasmatice, mari (2-3 m
diametru), net delimitate, au conţinut strălucitor (fig. 2, 5). În preparatele colorate Giemsa, aceste celule au fost cert
identificate ca aparţinând grupului granulocite + oenocitoide (GR+OE), conform criteriilor prezentate anterior, fapt uşor
de explicat chiar şi numai prin aceea că larvele au valoarea procentuală medie a acestui grup de 96%. Van Steenkiste
(7) a evidenţiat în culturile de hemocite obţinute de la L4 şi L5 numai GR. În plus faţă de GR+OE se observă, rar, şi
celulele mari şi cele de dimensiuni intermediare (fig. 4).
În godeurile H+CG, numărul de GR+OE este mai mic decât în godeurile H, predominând celulele mari. Acestea au
heterocromie pronunţată, în interiorul lor distingându-se două zone: o zonă centrală, mai densă, neclar delimitată, cu
aspect muriform (nucleul înconjurat de vezicule intim aderate, diametru de 13-20 m) şi o zonă periferică, inelară, mai
transparentă, conţinând numeroase granule / vezicule cu caractere asemănătoare cu cele ale GR+OE dar mai mari (3-
10 m diametru) (fig. 6, 7). La majoritatea celulelor, membrana citoplasmatică este evidentă, integră, netedă, existând
însă şi celule cu membrana întreruptă, la care granulele sunt în curs de dispersare (fig. 6, 7). Aceste celule, pe baza
caracterelor morfologice descrise, au fost identificate ca fiind celule grase. Tipul de celulă cu dimensiuni intermediare
este cel mai rar, are formă rotundă, nucleul relativ mare (10-13 m diametru), citoplasma inelară, heterocromie fină,
cu granule / vezicule mai mici decât cele de la celulele grase şi GR+OE (sub 2 m diametru), concentrate spre nucleu,
şi membrana observabilă, luminoasă, delimitată clar (fig. 4, 7). Zona nucleului este mai închisă, iar cea periferică mai
strălucitoare. Aceste celule au fost identificate ca fiind oenocite.
În intervalul 48 ore – 21 zile s-a constatat că GR+OE îşi menţin în general caracterele enumerate dar, după a 14-a zi de
la cultivare, membrana citoplasmatică începe să se încreţească, granulele / veziculele se aglomerează la periferie,
uneori chiar proeminând (probabil aflându-se în curs de exocitoză), astfel încât celulele devin muriforme, rămânând
însă vii. De asemenea, creşte proporţia celulelor grase dezintegrate, din acestea rămânând un număr mic de granule /
vezicule ataşate de nucleu, restul acestora fiind dispersate în mediu. În plus, membrana oenocitelor devine tot mai
greu de observat, celulele intrând probabil, într-un proces de dezintegrare.
Pentru GR+OE de L4-5, viabilitatea, în intervalul 5-14 zile, a variat între 81,1% (în a 5-a zi) şi 90,2% (în a 9-a zi). Pentru
GR+OE de L6-7 viabilitatea în intervalul 14-21 zile, a variat între 90,4% (în a 14-a zi) şi 60,7% (în a 21-a zi). Valorile
viabilităţii înregistrate pentru culturile de GR+OE de la L4-5 şi L6-7 sunt prezentate în tabelul 1 şi redate grafic în figura
1, comparativ cu cele obţinute de Van Steenkiste pentru GR provenite de la L5, la temperatura de 250C.

După o evoluţie ascendentă a viabilităţii până în a 9-a zi s-a înregistrat o uşoară scădere până în a 12-a zi şi
menţinerea în platou până în a 14-a zi, pentru GR+OE de L4-5 examinarea fiind oprită în a 14-a zi datorită infectării
culturii. Pentru GR+OE de L6-7 examinarea viabilităţii s-a efectuat numai în zilele 14, 18 şi 21 de la cultivare
înregistrându-se, după o valoare foarte apropiată de cea a hemocitelor de L4-5 la 14 zile o uşoară scădere a viabilităţii
în a 18-a zi, urmată de o scădere accentuată în a 21-a zi. Nu s-a putut continua examinarea culturii de L6-7 datorită
epuizării numărului de godeuri.
Din fig. 1 se observă faptul că valorile supravieţuirii GR+OE de L4-5 înregistrate de noi, pentru intervalul 5-14 zile, sunt
ceva mai mici decât cele obţinute de Van Steenkiste pentru GR de L5 cu până la 16% (în a 5-a zi) probabil datorită
incubării culturii la 25,5 – 28,50C, faţă de 250C, temperatura utilizată de Van Steenkiste (7).
La 18-21 de zile (probabil chiar din a 16-a zi) rezultatele noastre (pentru GR+OE de L6-7) sunt mai bune decât cele ale
lui Van Steenkiste, pentru GR de L5.

Concluzii
S-a reuşit stabilirea unui protocol de lucru pentru obţinerea de culturi de hemocite. Au fost obţinute culturi primare de
hemocite (± fragmente de corp gras) de la larve de albine lucrătoare în vârstă de 4-5 zile respectiv 6-7 zile. Au fost
caracterizate morfologic şi identificate atât hemocitele (GR+OE) cât şi celulele din fragmentele de corp gras (celule
grase şi oenocite).
A fost apreciată viabilitatea GR+OE pentru intervalul 5-21 zile, de menţinere a celulelor în cultură. Astfel, pentru GR +
OE de L 4-5, viabilitatea, în intervalul 5 – 14 zile, a variat între 81,1% (în a 5-a zi) şi 90,2% (în a 9-a zi), iar pentru GR+OE
de L6-7, în intervalul 14-21 zile, aceasta a variat între 90,4% (în a 14-a zi) şi 60,7% (în a 21-a zi).



Tabelul 1. Valorile viabilităţii înregistrate pentru culturile de GR+OE (granulocite + oenocitoide) provenite de la larve şi
albine în vârstă de 4 – 5 zile (L4-5) respectiv 6 – 7 zile (L6-7)

Timp (zile)        Viabilitate (%)
GR+OE (L4-5) GR+OE (L6-7)
5                81,1        ND
7                84,9        ND
9                90,2        ND
12             88,5        ND
14             88,5        90,4
18              ND        87,3
21              ND        60,7
ND = nedeterminat

Încercări de cultivare “in vitro” a hemocitelor albinei melifere, Apis mellifera L.

I. Sorescu1, R. Tănasă1, Lenuţa Gheorghe1, Aneta Mardare2, Gabriela Chioveanu2

1. S.N. “Institutul Pasteur” S.A. Bucureşti
2. Institutul de Diagnostic şi Sănătatea Animală
Bibliografie

1. Giauffret A. (1971) – Cell culture of Hymenoptera. In: Vago C (Ed),
Invertebrate tissue culture, Academic Press, New York, Vol 1, 295 - 305
2. Snodgrass R.E. (1956) – Anatomy of the honey bee. Comstock
Publishing Associates, Ithaca, New York, 5-9, 205
3. Sorescu I. (1998) – Cercetări privind răspunsul imun în principalele
boli bacteriene şi micotice ale albinei melifere, Apis mellifera L. Teză
de doctorat, USAMV Bucureşti, 245-292
4. Sorescu I., Turcu D. (1998) – Contribuţii privind hemocitele albinei
melifere (Apis mellifera L.): caractere morfologice, multiplicare şi
răspândire în organism. Studii şi Cercetări de Medicină Veterinară
(Institutul Pasteur)
5. Stanley M. (1968) – Initial results of honey bee tissue culture. Bulletin
Apicole, T11, No. 1, 45-55
6. Summers M.D., Smith G.E. (1987) – A manual of methods for
baculovirus vectors and insect cell culture procedures. Texas Agriculture
Experiment Station Bulletin No. 1555, Texas
7. Van  Steenkiste  D.  (1988)  -  De  hemocyten  van  de  honingbij  (Apis
mellifera L.): typologie, bloedbeeld en cellulaire verdedigingsreacties.
Doctoraatsproefschrift, Rijksuniversiteit Gent, Belgium, 95-105
Antibiogram
Encyclopedia
Culture media
Biochemical tests
Stainings
Images
Movies
Articles
Identification
Software
R E G N U M
PROKARYOTAE
Previous page
Back