Home   Articles                                                           


 

 

 

Formula hemocitară (Differential Hemocyte Count – D.H.C.) şi indicele fagocitar īn infecţiile bacteriene

experimentale şi īn ascosferoza naturală, la albina meliferă (Apis mellifera L.)

īn diferite stadii de dezvoltare ontogenetică

 

I. Sorescu1, C. Dragomir2

 

1. S.N. “Institutul Pasteur” S.A. Bucureşti

2. Institutul de Biologie şi Nutriţie Animală - Baloteşti

 

Cuvinte cheie: Formula hemocitară, Differential Hemocite Count - DHC, indice fagocitar, infecţii bacteriene experimentale, ascosferoză, albina meliferă

 

Rezumat

S-a calculat şi analizat valoarea procentuală medie, abaterea standard şi coeficientul de variabilitate, DHC (Differential Hemocite Count) la larve, pupe şi albine adulte cu infecţii bacteriene experimentale [Bacillus (Paenibacillus) larvae, E. coli, B. (P.) alvei, B. laterosporus şi B. circulans] şi la cele provenite dintr-o familie cu ascosferoză naturală. Aceasta a permis aprecierea modificării DHC īn aceste infecţii sugerarānd direcţiile şi sensurile de modificare a proporţiilor populaţiilor de hemocite īn principalele boli bacteriene şi micotice ale albinei melifere (loca americană, loca europeană şi ascosferoza).

De asemenea, a fost calculat şi analizat (medie, abatere standard şi coeficient de variabilitate) indicele fagocitar la albine cu infecţii bacteriene experimentale fapt ce a permis aprecierea implicării procesului fagocitar īn aceste infecţii.

 

Introducere

Este cunoscut faptul că, la insecte, infecţiile bacteriene determină modificări ale raportului procentual dintre diferitele tipuri de hemocite din hemolimfă (formulă hemocitară, Differential Hemocite Count - DHC) (15). La albina meliferă (Apis mellifera L.) Van Steenkiste (13) a efectuat infecţii experimentale, la adulte, cu E.coli, Serratia marcescens şi Erwinia carotovora, urmărind supravieţuirea albinelor infectate precum şi capacitatea fagocitară a granulocitelor (GR) cultivate “in vitro”.Īn condiţii experimentale similare, Casteels et al., 1988 (4), au constatat  că fagocitoza nu contribuie la eliminarea celulelor bacteriene din hemolimfă. NU se fac, īn ambele lucrări, referiri la DHC. Papadopoulou-Karabela et al., 1983 (10), au determinat modificările DHC la albine adulte infectate experimental cu Pseudomonas aeruginosa. Wille şi Vecchi, 1974 (16), au determinat modificările DHC la adultele cu septicemie, nosemoză şi cu infecţii mixte, dar ei au utilizat o clasificare actualmente depăşită a hemocitelor. Nu am īntālnit, īn literatura consultată, alte date privind modificarea DHC la albina meliferă īn infecţiile bacteriene. De asemenea, nu am īntālnit date privind analiza DHC īn infecţiile micotice ale insectelor, inclusiv ale albinei melifere.

Īn acest context, calcularea şi analiza DHC (stabilirea valorii procentuale medii, a abaterii standard şi a coeficientului de variabilitate pentru fiecare tip de hemocit din toate loturile şi subloturile de insecte) la larve, pupe şi albine adulte cu infecţii bacteriene experimentale şi la cele provenite dintr-o familie cu ascosferoză naturală, ar putea sugera direcţiile şi sensurile de modificare a raporturilor dintre populaţiile de hemocite īn principalele boli bacteriene şi micotice ale albinei melifere.

Īn aceste condiţii, modificarea DHC ar putea constitui cel puţin imaginea unor mecanisme celulare de apărare imună, dacă nu chiar un mecanism īn sine, īntrucāt creşterea proporţiei unor hemocite şi scăderea proporţiei altora permite, īn ansamblu, amplificarea exprimării funcţiilor primelor şi menţinerea scăzută a exprimării funcţiilor celor din urmă. Astfel, creşterea proporţiei (valorii procentuale medii) GR+OE [hemocitelor din categoria granulocite + oenocitoide, (12)] poate arăta importanţa fagocitozei funcţie īndeplinită exclusiv de această categorie de hemocite. Īn acest mod, creşterea proporţiei GR+OE este un mecanism celular de apărare, iar modificarea DHC īnsumează exprimarea (imaginea) creşterii şi descreşterii procentuale a tuturor tipurilor de hemocite.

Īn plus, calcularea şi analiza (media, abatere standard şi coeficient de variabilitate) indicelui fagocitar la insectele cu infecţii bacteriene experimentale permite aprecierea implicării procesului fagocitar īn aceste infecţii şi, implicit, sugerează gradul de implicare a acestui mecanism īn infecţiile bacteriene naturale ale albinei melifere.

 

Material şi metode

a) Insecte

Au fost utilizate albine (larve pupe, adulte) provenite dintr-o familie cu ascosferoză naturală (lotul II) şi din familii de albine clinic sănătoase aparţinānd aceleiaşi stupine (loturile I, III, IV şi V). Modul şi condiţiile de īntreţinere şi hrănire ale insectelor īn laborator au fost prezentate īntr-un articol anterior (12).

Īn privinţa insectelor provenite dintr-o familie cu ascosferoză naturală, īntrucāt larvele şi pupele tinere vizibil afectate de ascosferoză (acoperite cu miceliu) sunt deja moarte (1) am fost nevoiţi să lucrăm cu larve, pupe tinere şi, chiar dacă sunt rezistente la infecţie, cu pupe aflate īn stadii mai avansate de dezvoltare, şi cu adulte eclozionate din astfel de pupe, clinic sănătoase, aflate īnsă īn imediata vecinătate a puietului mort. Deci, s-a lucrat cu insecte clinic sănătoase care sunt īn mod cert contaminate cu spori de Ascosphaera apis şi la care (aspect valabil mai ales pentru larvele şi pupele tinere) este posibil ca procesul infecţios să se afle īn diferite faze (inaparente clinic) de evoluţie. Certitudinea contaminării acestor insecte este dată de faptul că aceleaşi albine adulte manifestă atāt comportament igienic [de la vārsta de 1-2 zile (9)] cāt şi comportament de īngrijire, de hrănire a larvelor [de la 3 la 12 zile, devenind albine doică (9)]. Astfel, pe de o parte, albinele adulte, prin īncercarea lor de a elimina din celulele fagurelui “mumiile” ascosferice (larvele moarte de ascosferoză), se contaminează masiv cu spori de A. apis (pe aparatul bucal, membre, torace, etc.), iar pe de altă parte, prin hrănirea şi īngrijirea larvelor, realizează contaminarea acestora cu spori, pe cale digestivă (2, 3, 6, 8) sau /şi pe cale transcuticulară (7, 8, 14). Īn tabelul 1 se prezintă numărul de insecte pentru fiecare sublot de vārstă al lotului II, pentru care DHC-ul a putut fi determinat. Lotul I a fost alcătuit din 30 albine adulte, lucrătoare, de iarnă, īn vārstă de aproximativ 150 zile. Loturile III, IV, V au fost utilizate pentru infecţiile bacteriene experimentale.

 

b) Infecţiile bacteriene experimentale

Protocolul de lucru a fost adaptat după Casteels et al. (5). Infecţiile experimentale au fost realizate cu:

- Bacillus (Paenibacillus) larvae FMV 11908, inoculāndu-se cāte 1 μlitru suspensie īn PBS de celule vii, de 72 ore (=1,3 x 104 UFC sau 5,2 x 103 UFC), per insectă;

- B. (P.) larvae FMV 11908, inoculāndu-se cāte 1 μl cultură de 72 ore īn BHI – bulion (=4,2 x 103 UFC) per insectă;

- E. coli 574 INMV Pasteur, inoculāndu-se cāte 1 μl suspensie īn PBS de celule vii, de 24 ore (=5 x 104 UFC) per insectă;

- B. (P.) alvei FMV 11909-A, inoculāndu-se cāte 1 μl suspensie īn PBS de celule vii, de 24 ore (=1,5 x 103 UFC sau 5 x 104 UFC), per insectă;

- B. laterosporus FMV 11917-A, inoculāndu-se cāte 1 μl suspensie īn PBS de celule vii, de 24 ore (=3,4 x 103 UFC), per insectă;

- B. circulans FMV 11906-B, inoculāndu-se cāte 1 μl suspensie īn PBS de celule vii, de 24 ore (=5 x 104 UFC), per insectă;

De asemenea, un număr de insecte au fost inoculate cu cāte 1 μl PBS (tampon fosfat salin, pH 7,2), iar din fiecare lot au fost lăsate neinoculate un număr de insecte martor pentru fiecare stadiu de dezvoltare īn parte (cu două excepţii). Structura fiecărui lot īn parte, modificată īn urma efectuării inoculărilor respective, este redată īn tabelele 2 - 4. Pentru Inoculări s-au utilizat seringi Hamilton (Koehn Co., Brea, California) cu capacitate de 10 μl, zonele de inoculare fiind: īntre segmentele abdominale IV-V lateral (pentru larve), şi īntre segmentele abdominale V-VI, lateral (pentru pupe şi pentru adulte). Īnainte de inoculare, suprafaţa cuticulei afost decontaminată prin tamponare uşoară cu un tampon (băţ de chibrit cu vată) īmbibat cu alcool etilic 75%. Albinele adulte au fost amorţite prin ţinere 15 minute la 40C iar pupele şi mai ales larvele au fost manipulate cu foarte mare atenţie (cu ajutorul unei pense oftalmologice) pentru a nu le produce leziuni. După inoculare, larvele şi pupele au fost puse īn plăci Petri şi menţinute la termostat (29-300C) 20-24 ore. Adultele au fost trecute īn alte cuşti Foti şi menţinute şi ele la 29-300C 20-24 ore. Insectele martor neinoculate au suportat exact aceleaşi manipulări (condiţii) ca şi cele inoculate cu PBS sau cu bacterii (cu excepţia inoculării).

 

c) Determinarea şi analiza DHC-ului şi a indicelui fagocitar

După 20-24 ore de la inoculare, se extrage cāte o picătură de hemolimfă (eventual, adultele se pot amorţi prin menţinere 10 minute la 40C sau se pot decapita) şi se efectuează frotiurile colorate prin metoda Giemsa adaptată (12). Concomitent, se extrage hemolimfă şi se efectuează frotiuri şi de la insectele lotului II.

Īn plus, de la aceleaşi insecte se extrage hemolimfa şi pentru investigarea răspunsului imun mediat umoral (se va reveni īntr-un articol viitor). Alte insecte, cu şi fără infecţie, au fost, de asemenea, prelucrate pentru TEM (12). Frotiurile din hemolimfa albinelor īn lotul I au fost realizate anterior, după acelaşi protocol.

Frotiurile colorate Giemsa se examinează, identificāndu-se hemocitele (12) şi numărāndu-se īn total 100 hemocite per frotiu (excepţie au făcut frotiurile de la albinele din lotul I, unde s-au numărat peste 100 hemocite). “Īnsumarea” valorilor procentuale ale tipurilor şi categoriilor de hemocite alcătuieşte DHC-ul insectei respective. Deşi Van Steenkiste, 1988 (13), recomandă numărarea a 200 hemocite pentru determinarea DHC-ului, am fost obligaţi să numărăm doar cāte 100 celule/frotiu (cu excepţia notată) deoarece sunt foarte puţine frotiurile care ajung la un conţinut de 200 celule. Mai mult decāt atāt, aproximativ 30% dintre frotiuri am fost nevoiţi să le eliminăm deoarece prezentau mult sub 100 hemocite.

Analiza DHC-ului s-a efectuat pentru fiecare sublot de vārstă şi tip de infecţie īn parte, iar īn cadrul acestora diferenţiat īn funcţie de intensitatea, cel puţin aparentă, a multiplicării bacteriilor īn hemolimfă (apreciată, īntr-un mod aproximativ, prin numărul de bacterii libere īn hemolimfă per cāmp microscopic al frotiului), stabilind valoarea procentuală medie (v.p.m.) a fiecărui tip / categorie de hemocit, abaterea standard (a.s.), coeficientul de variabilitate (c.v.) şi limitele minimă (min) şi maximă (max) a valorii procentuale.

Īntrucāt, pentru marea majoritate a subloturilor, numărul de insecte pentru care DHC a putut fi determinat a fost mai mic de 10, iar coeficientul de variabilitate a fost, de regulă, mai mare de 10%, nu au putut fi aplicate teste statistice de analiză a diferenţelor dintre acestea.  De aceea, s-au evidenţiat doar modificările v.p.m. a fiecărui tip de hemocit din subloturile cu diferite infecţii (inclusiv inoculare cu PBS şi cele din familia cu ascosferoză) faţă de v.p.m. a hemocitelor subloturilor martor neinoculate din acelaşi lot, pentru diferite stadii de dezvoltare ontogenetică, deci modificările DHC-ului mediu. Pentru ascosferoză, unde nu a existat posibilitatea unui martor propriu lotului comparaţia s-a făcut cu v.p.m. rezultată din īnsumarea tuturor subloturilor martor neinoculate de aceeaşi vārstă cu subiectul comparaţiei, din celelalte loturi.

Prin examinarea microscopică a frotiurilor din hemolimfa insectelor cu infecţii bacteriene experimentale au putut fi observate şi hemocite fagocitare. Raportul dintre numărul de hemocite fagocitare (surprinse īn timpul procesului de fagocitoză) şi numărul total de hemocite examinate (100, īn cazul nostru) reprezintă indicele fagocitar (if) (15).

Īntrucāt GR+OE reprezintă singura categorie de hemocite cu capacitate fagocitară (date nepublicate) [Van Steenkiste, 1988 (13), demonstrānd că GR constituie unicul tip fagocitar] am considerat util a determina diferenţiat ceea ce am denumit “indicele fagocitar total” (ift) (numărul de hemocite fagocitare raportat la numărul total de hemocite examinate) şi “indicele fagocitar GR+OE” (ifg) (numărul de GR+OE fagocitare raportat la numărul total de GR+OE), īn scopul evidenţierii gradului de implicare a GR+OE īn procesul fagocitar. Analiza “ift”-ului şi a “ifg”-ului s-a efectuat pentru fiecare sublot de vārstă şi tip de infecţie īn parte, iar īn cadrul acestora diferenţiat īn funcţie de intensitatea, cel puţin aparentă, a multiplicării bacteriilor īn hemolimfă (apreciată, īntr-un mod aproximativ, prin numărul de bacterii libere īn hemolimfă per cāmp microscopic al frotiului), stabilind v.p.m. a fiecăruia, a.s., c.v.-ul şi min. şi max. valorilor acestora. S-a evidenţiat variaţia v.p.m. a ift-ului şi ifg-ului la subloturile cu diferite infecţii, cu diferite intensităţi de multiplicare a bacteriilor īn hemolimfă şi aflate īn diferite stadii de dezvoltare ontogenetică.

 

Rezultate şi discuţii

Rezultatele analizelor DHC-ului, ift-ului şi ifg-ului efectuate pentru fiecare sublot de vārstă, sex şi tip de infecţie īn parte, sunt redate īn tabelele 5-12.

Īn tabelele 13-17 sunt evidenţiate modificările v.p.m. ale fiecărui tip / categorie de hemocit din subloturile cu diferite infecţii (inclusiv cele cu inoculare de PBS şi cele provenite din familia cu ascosferoză) faţă de v.p.m. a hemocitelor subloturilor martor neinoculate din acelaşi lot, pentru diferite stadii de ddezvoltare ontogenetică, deci modificările DHC-ului mediu.

Astfel, īn urma inoculării cu PBS s-au constatat următoarele modificări (īn condiţiile īn care nu s-au făcut determinările acestora şi pentru stadiile de pupă cu ochi bruni şi adult 0-6 zile) (tabel 13): v.p.m. a PL1+PR (plasmatocit rotund + prohemocit), PL2 (plasmatocit intermediar) şi PL4 (plasmatocit fusiform) a scăzut, la adultele de 7-45 de zile, dar destul de puţin; v.p.m. a PL3 (plasmatocit oval) a crescut, la adultele de 7-45 de zile, dar destul de puţin (la larve şi pupe ochi albi şi ochi roz v.p.m. a PL1+PR, PL2, PL3, PL4 pentru aceste subloturi comparate fiind zero);  v.p.m. a GR+OE a crescut mult (de aproximativ 4 ori) la adultele de 7-45 zile, la larve, pupe ochi albi şi pupe ochi roz īnregistrāndu-se doar scăderi foarte reduse; v.p.m. a CO (coagulocite) aproape că s-a dublat la larve, a crescut, dar mai puţin, la pupe şi a scăzut la adulte.

Van Steenkiste, 1988 (13), īn urma inoculării de tuş de India la albine de vară de vārstă neprecizată, a observat că, la 24 ore post-inoculare, PL1 şi PL3 cresc, PL2 scade nesemnificativ iar GR, CO şi PL4 cresc semnificativ, aceste rezultate fiind apropiate faţă de cele obţinute de noi.

Creşterea v.p.m. a GR+OE şi a CO la subloturile (adulte şi respectiv larve) inoculate cu PBS poate sugera faptul că agresiunea īn sine (inocularea) este capabilă să inducă aceste creşteri, probabil ca primă etapă a “pregătirii” organismului pentru posibilele invazii bacteriene care s-ar putea realiza prin leziunea creată de agresiune, avānd īn vedere faptul că aceste tipuri celulare sunt implicate īn fagocitoză (GR+OE) şi īn formarea de noduli (GR+OE şi CO) (13; se va reveni īntr-un articol viitor).

Īn urma inoculării cu B. (P.) larvae F.M.V. 11908 (celule vii suspendate īn PBS) [deci, īn infecţiile experimentale cu B. (P.) larvae] (tabelul 14) au fost constatate următoarele modificări (īn condiţiile absenţei determinării acestora şi pentru stadiul de pupă cu ochi albi) (tabelul 14):

- PL1+PR scade la adulte şi apare la pupe ochi roz;

- PL2 creşte la adultele de 0-6 zile dar scade la adultele de 7-45 zile;

- PL3 creşte la adulte;

- PL4 apare (la martor nu există) la adultele de 0-6 zile dar scade la adultele de 7-45 zile;

- GR+OE creşte puţin la adultele de 0-6 zile şi mai mult la adultele de 7-45 zile;

- CO creşte doar la larve şi scade la restul stadiilor.

Este interesant faptul că PL1+PR (de notat că el nu apare la inocularea pupelor ochi roz cu PBS), PL2, PL3, PL4 şi GR+OE sunt modificate īn acelaşi mod ca la subloturile inoculate cu PBS (cu excepţia notată) īn timp ce CO sunt modificate la fel pentru larve şi adulte dar diferit (invers) pentru pupe. Această observaţie permite două constatări:

a) īn general, īn infecţia experimantală cu B.(P.) larvae nu se constată (cu două excepţii) modificările v.p.m. ale hemocitelor diferite de cele īnregistrate īn inoculările cu PBS, ceea ce īnseamnă că supoziţiile emise, īn acel context, devin probabile; b) se verifică prezenţa acestor modificări pentru ambele categorii de comparaţii, modificările cāştigānd īn rigurozitate.

Astfel, creşterea GR+OE la adultele de 7-45 zile şi a CO la larve se datorează inoculării īn sine, ca agresiune, infecţia experimentală cu B.(P.) larvae nedeterminānd nici o modificare suplimentară. Īnsă, trebuie subliniat faptul că la larve şi la pupe, GR+OE, īn mod normal, au valori procentuale de peste 90% astfel īncāt, pe de o parte, semnificaţia uşoarei creşteri sau scăderi a acestei categorii de hemocite, la aceste stadii, este practic nulă, iar pe de altă parte īnseamnă că, īn mod natural, larvele şi pupele sunt permanent “pregătite” cu un număr maxim (procentual) de celule capabile de fagocitoză şi de formarea de noduli. La īntrebarea “de ce s-a mai investigat, atunci, DHC-ul, la larve şi la pupe cu infecţii?” răspunsul este: a) pentru a fi sigur că, īntr-adevăr, DHC-ul calculat la martorii neinoculaţi, pe un număr mic de insecte, este unul apropiat de realitate, b) pentru a observa dacă, prin infecţii, nu apar cumva, mai devreme īn ontogenie, faţă de martorul neinoculat, diferite tipuri de hemocite [fapt constatat chiar la infecţia cu B.(P.) larvae, PL1+PR nefiind prezent la pupele cu ochi roz martor dar apărānd la acest stadiu īn urma infecţiei şi nu a inoculării cu PBS] şi c) pentru că, la pupe ochi bruni deja apar şi alte tipuri de hemocite (PR+PL1 şi PL2), posibilităţile de modificare a DHC-ului fiind mai multe.

Nu avem o explicaţie privind semnificaţia apariţiei PL1+PR mai devreme, īn ontogenie, la pupe ochi roz, īn infecţia experimentală cu B.(P.) larvae. Fapt este că această apariţie pare a fi indusă de infecţia cu B.(P.) larvae şi nu de inoculare. De asemenea, se pare că infecţia a indus şi apariţia PL4 la adulte 0-6 zile.

Creşterea GR+OE la adulte [atāt la inocularea cu PBS cāt şi la inocularea cu B.(P.) larvae] poate sugera faptul că fagocitoza este importantă īn apărarea imună la acest stadiu. Prezenţa numărului foarte mare de GR+OE la larve şi la pupe arată că, la aceste stadii, fagocitoza este, foarte probabil, esenţială, ca mecanism īn apărarea īmpotriva tuturor infecţiilor bacteriene şi micotice. Rămāne ca acest fapt să fie corelat cu rezultatele investigării ift-ului şi a ifg-ului.

Īn urma inoculării cu B.(P.) alvei F.M.V. 11909-A (tabelul 15) au fost constatate următoarele modificări (īn condiţiile nedeterminării acestora pentru larve, pupe ochi albi şi roz şi adulte 0-6 zile) (tabelul 15):

- PL1+PR şi PL2 scad mai mult de jumătate la adultele de 7-45 zile, deci mai mult decāt la inocularea cu PBS şi la infecţia cu B.(P.) larvae;

- PL1+PR creşte slab la pupe cu ochi bruni, la fel ca şi la infecţia cu B.(P.) larvae;

- PL2 creşte foarte puţin la pupe cu ochi bruni, īn timp ce la infecţia cu B.(P.) larvae scade foarte puţin;

- PL3 creşte la adultele de 7-45 zile la fel ca şi la inocularea cu PBS şi cu B.(P.) larvae;

- PL4 scade la jumătate, aproape la fel ca la celelalte tipuri de inoculări;

- GR+OE creşte de aproximativ 50 ori la adultele 7-45 zile, deci mai mult decāt la celelalte două inoculări;

- CO scade la adultele de 7-45 zile la fel ca şi la celelalte două inoculări şi creşte la pupe ochi bruni, spre deosebire de inocularea cu B.(P.) larvae, unde scădea.

Īn general se confirmă, şi prin această infecţie experimentală, sensul modificărilor deja constatate pentru primele două inoculări, īn unele cazuri chiar prin valori apropiate, deosebirile remarcate la infecţia cu B.(P.) alvei fiind: scăderea accentuată a PL1+PR şi PL2 la adultele de 7-45 zile (semnificaţie necunoscută), creşterea mult mai pronunţată a GR+OE [ceea ce ar putea semnifica o implicare mai intensă a fagocitozei īn infecţia experimentală cu B.(P.) alvei decāt īn cea cu B.(P.) larvae, la adultele de 7-45 zile şi, īn plus, probabil, inducerea creşterii GR+OE şi, implicit, a fagocitozei, nu numai prin inoculare ci şi prin infecţia cu B.(P.) alvei īn sine] şi creşterea CO la pupe ochi bruni (ar putea semnifica o creştere a capacităţii de formare de noduli].

Īn urma inoculării cu E. coli 574 Pasteur (tabelul 16) au fost constatate următoarele modificări (īn condiţiile nedeterminării acestora pentru pupe ochi roz, bruni şi pentru adultele 0-6 zile) (tabelul 16):

- PL1+PR scade puţin, mai puţin decāt la primele trei inoculări, la adult 7-45 zile;

- PL2 scade mai mult decāt la primele trei inoculări;

- PL3 creşte, la fel ca la primele trei inoculări;

- PL4 creşte, la adult 7-45 zile, spre deosebire de toate celelalte inoculări, unde a scăzut;

- GR+OE scad la adult 7-45 zile, spre deosebire de toate celelalte inoculări unde a crescut;

- CO a crescut (de aproximativ 16 ori) la adult de 7-45 zile şi a scăzut la larve, adică invers faţă de infecţia cu B.(P.) larvae şi faţă de inocularea cu PBS.

Se observă că, dacă modificările PL1+PR, PL2, PL3 respectă sensul celor de la primele trei inoculări, modificările īnregistrate de PL4 (semnificaţie necunoscută), GR+OE [foarte probabil, semnifică neimplicarea procesului fagocitar īn infecţia cu E.coli a adultelor de 7-45 zile, supoziţie sprijinită şi de rezultatele cercetărilor lui Casteels et al., 1988 (4), efectuate tot cu E. coli şi albine adulte] şi CO (probabil că, īn absenţa creşterii GR+OE, şi implicit īn condiţiile neimplicării procesului fagocitar īn infecţia cu E. coli, cresc foarte mult CO, care ar contribui la creşterea capacităţii de formare a nodulilor, proces care ar presupune, īnsă, şi contribuţia GR+OE, dar ar determina şi intensificarea capacităţii de coagulare a hemolimfei) sunt total contrare modificărilor de la inocularea cu PBS şi de la infecţiile experimentale cu B.(P.) larvae şi B.(P.) alvei. Acest fapt este foarte interesant īntrucāt: a) demonstrează că infecţia bacteriană poate induce modificări ale DHC-ului contrare, şi, deci, independente de cele induse de inocularea īn sine; b) aceste modificări din lotul cu infecţia experimentală cu E.coli sunt chiar induse de infecţia cu E. coli, altfel neputānd fi explicate, pe de o parte, diferenţele faţă de modificările lotului cu inoculare cu PBS, pe de altă parte, diferenţele flagrante faţă de propriul sublot martor, neinoculat; c) demonstrează posibilitatea inducerii unor modificări diferite ale DHC-ului īn infecţii bacteriene diferite ceea ce, pentru sistemul imun al insectelor, este un fapt remarcabil, sugerāndu-se, implicit, existenţa unui grad, cel puţin incipient, de selectivitate, de specificitate a (activării) mecanismelor imunităţii mediate celular īn infecţiile bacteriene, cu atāt mai mult cu cāt se constată diferenţe ale modificărilor DHC-ului īntre E.coli pe de o parte şi B.(P.) larvae şi B.(P.) alvei pe de altă parte, şi mai puţin īntre infecţiile acestora din urmă; d) sugerează că, şi īn cazul infecţiilor experimentale cu cei doi bacili, este foarte probabil ca modificările īnregistrate, dacă sunt evident mai marcate decāt cele ale subloturilor inoculate cu PBS, chiar dacă īn acelaşi sens, sau, cu atāt mai mult, dacă sunt contrare, sau diferite faţă de acestea sau īntre ele, să fie induse de către infecţiile bacteriene īn sine şi, implicit, să fie semnificative (de extrapolat la) şi pentru infecţiile similare naturale.

La subloturile de insecte provenite din familia cu infecţie naturală cu A. apis (tabelul 17) au fost constatate următoarele modificări (īn condiţiile nedeterminării acestora pentru pupe ochi roz şi a comparării unei pupe ochi albi de trāntor cu pupe ochi albi de lucrătoare martore neinoculate):

- PL1+PR apare la pupe ochi albi (atenţie, e pupă de trāntor comparată cu pupe martor de lucrătoare; oricum este puţin probabil ca PL1+PR să existe şi la pupe de trāntori neinoculate cu ochi albi īntrucāt, la pupele ochi roz trāntori martori, v.p.m. = 1,33%), creşte foarte puţin la pupe ochi bruni (ca şi la infecţiile cu bacili) şi creşte ceva mai mult la adulte (spre deosebire de toate infecţiile bacteriene şi de inocularea cu PBS);

- PL2 la pupe ochi bruni creşte de aproximativ 4 ori [la infecţiile cu B.(P.) larvae şi B.(P.) alvei scăzānd şi, respectiv, crescānd foarte puţin], creşte mai puţin la  adultele  de  0-6 zile [ca şi la infecţia cu B.(P.) larvae] şi scade la adultele de 7-45 zile (ca la toate inoculările);

- PL3 creşte puţin la adultele de 0-6 zile [mai puţin decāt la infecţia cu B.(P.) larvae] şi scade la jumătate la adultele de 7-45 zile, contrar tuturor inoculărilor;

- PL4 apare la adultele de 0-6 zile (la martor nu există), ca şi la infecţia cu B.(P.) larvae, şi dispare la adultele de 7-45 zile (existānd la martor), contrar tendinţelor de a creşte de la infecţia cu E.coli, şi īn consens cu tendinţa de scădere de la celelalte inoculări;

- GR+OE scade la adultele de 0-6 zile, contrar infecţiei cu B.(P.) larvae, şi creşte de aproximativ 36 de ori la adultele de 7-45 zile, īn consens cu toate inoculările, cu excepţia celei cu E.coli;

- CO cresc la larvae, īn consens cu toate inoculările, cu excepţia celei cu E.coli, scade la pupe ochi albi (trāntor), invers faţă de modificarea de la inocularea cu PBS şi cu E.coli, creşte la pupe ochi bruni, ca şi la inocularea cu B.(P.) alvei dar contrar inoculării cu B.(P.) larvae, scade la adultele de 0-6 zile, ca şi la inocularea cu B.(P.) larvae şi creşte la adultele de 7-45 zile, mai puţin decāt la inocularea cu E.coli dar contrar tuturor celorlalte inoculări.

Modificările importante, şi manifestate faţă de toate inoculările, sunt: apariţia PL1+PR la pupe ochi albi (īnregistrată la pupa de trāntor), creşterea PL1+PR la adulte, creşterea PL2 la pupele ochi bruni, scăderea PL3 la adultele 7-45 zile.

Faptul că s-au īnregistrat modificări ale PL1+PR, PL2 şi PL3 diferite (contrare) faţă de toate celelalte inoculări (bacteriene şi cu PBS), sugerează posibilitatea ca aceste modificări să fie caracteristice insectelor provenite din familia cu infecţie naturală cu A. apis şi, implicit, ca ele (modificările) să fie induse (relativ specific) de infecţia inaparentă clinic cu acest fung. Semnificaţia apariţiei PL1+PR la pupe ochi albi, a creşterii acestor hemocite la adulte, a creşterii PL2 la pupele ochi bruni şi a scăderii PL3 la adultele de 7-45 zile ne este necunoscută, chiar şi la nivel ipotetic [totuşi, nu este exclus  să semnifice activarea procesului de īncapsulare īn care, probabil, sunt implicate aceste celule – se va reveni īntr-un capitol viitor). Bineīnţeles că şi celelalte modificări, ale celorlalte tipuri de hemocite, sunt probabil induse tot de infecţia inaparentă clinic cu A. apis dar, fiind comune (relativ) cu modificările induse de inoculările bacteriene, sunt categoric necaracteristice ascosferozei,

 

Īn tabelele 18 şi 19 sunt evidenţiate variaţiile valorilor medii ale ift-ului şi ifg-ului la subloturile cu diferite infecţii, cu diferite intensităţi de multiplicare a bacteriilor īn hemolimfă şi aflate īn diferite stadii de dezvoltare ontogenetică.

Īn condiţiile nedeterminărilor pentru unele infecţii şi unele vārste, s-a constatat că:

- cu cāt numărul de bacterii libere īn hemolimfă este mai mare, cu atāt ift-ul şi ifg-ul sunt mai mari şi invers;

- la acelaşi număr (aproximativ) de bacterii libere, de aceeaşi specie [B.(P.) larvae] īn hemolimfă, ift a fost maxim la larve şi a scăzut treptat odată cu avansarea īn vārstă, fiind minim la adultele de 7-45 zile. Aceiaşi constatare şi pentru infecţia cu B.(P.) alvei şi cu E. coli a (0-5 bacterii libere īn hemolimfă per cāmp microscopic). Ifg a variat la fel pentru infecţia cu B.(P.) alvei şi cea cu B.(P.) larvae a (0-10 bacterii libere) dar a variat invers pentru infecţia cu B.(P.) larvae b (11-80 bacterii libere), avānd valoare mai mare la adulte 7-45 zile şi mai mică la adulte 0-6 zile, şi nu a variat pentru infecţia cu E.coli b (40-200 bacterii libere) īntre larve şi pupe (ca şi ift-ul pentru E.coli b);

- ift-ul cel mai mare s-a īnregistrat īn infecţia cu E. coli, urmată de infecţia cu B. (P.) alvei, la pupe ochi albi şi, respectiv, la pupe ochi bruni;

- ifg-ul cel mai mare s-a īnregistrat īn infecţia cu B. (P.) larvae, urmată de infecţia cu E. coli, la adulte şi, respectiv, la larve şi pupe ochi albi;

Astfel, se pare că if este, mai curānd, funcţie de intensitatea infecţiei (a multiplicării bacteriene īn hemolimfă) decāt un indiciu pozitiv al eficienţei fagocitozei īn apărarea īmpotriva infecţiei. Am constatat următoarele relaţii:

a) ifg redus, numărul bacteriilor libere tinde către 0 => infecţie redusă şi eficienţă ridicată a fagocitozei;

b) ifg crescut, numărul bacteriilor libere crescut => infecţie puternică şi eficienţă redusă a fagocitozei;

Īn infecţia cu B. (P.) larvae, la larve, ift este aproximativ 0,29 la un număr de 0-10 bacili liberi / cāmp frotiu, ceea ce poate īnsemna o infecţie medie, cu un ift mediu, īn timp ce, la pupe şi cu atāt mai mult la adulte, ift scade sub 0,1. La adulte este mai semnificativ ifg īntrucāt numărul de GR+OE este mult mai mic decāt la stadiile preimaginale. Astfel, la adulte de 7-45 zile, la 11-80 bacterii libere se constată ift 0,043 şi ifg 0,93, ceea ce demonstrează că GR+OE sunt aproape 100% fagocitare īn această infecţie la acest stadiu, la acest număr de bacterii libere. Deci, īn infecţiile reduse fagocitoza pare să fie eficientă īnsă, cānd numărul de bacterii libere īn hemolimfă depăşeşte cāteva zeci / cāmp, fagocitoza devine ineficientă, īn ciuda mobilizării a aproape īntregului număr de GR+OE. Ca mecanism de apărare, fagocitoza este intens implicată īn infecţia experimentală şi foarte probabil, şi īn infecţia naturală cu B.(P.) larvae.

Īn infecţia experimentală cu B.(P.) alvei la pupe ochi bruni şi adulte 7-45 zile, s-au constatat 15-50 bacili liberi / cāmp la pupe, un ift = 0,42 şi un ifg = 0,49, şi 0-10 bacili la adulte, cu ift = 0,01 şi ifg = 0,04, ceea ce sugerează o implicare intensă a fagocitozei īn infecţia experimentală şi, foarte probabil şi īn infecţia naturală cu B.(P.) alvei, mai ales la pupe unde, īnsă, mecanismul devine ineficient. La adulte probabil că mecanismul este mai eficient, nefiind īnsă exclusă intervenţia, īn paralel, şi a altor mecanisme de apărare. Deci, probabil că şi īn infecţia cu B.(P.) alvei, fagocitoza este eficientă numai cānd numărul de bacili liberi īn hemolimfă este mic.

Şi īn infecţia experimentală cu Escherichia coli s-a constatat o implicare intensă a fagocitozei (ift = 0,58, ifg = 0,62 pentru larve) dar şi totala ineficienţă a acesteia la larve şi pupe, existānd şi cāmpuri cu cāte 200 bacterii la pupele ochi albi.

 

Deşi aceste infecţii experimentale au fost realizate prin inoculare transcuticulară īn hemocel, considerăm că toate rezultatele obţinute sunt semnificative şi pentru infecţiile naturale (realizate obişnuit, pe cale digestivă) deoarece, de exemplu, B.(P.) larvae are capacitatea de a depăşi, la larvele de 3-5 zile, bariera intestinală (11) ajungānd īn hemolimfă, unde se multiplică intens, determinānd septicemie (3, 11). Noi am introdus īn hemocel exact forma vegetativă a lui B.(P.) larvae, simulānd astfel situaţia din natură, cel puţin pentru larve, astfel īncāt, īn mod sigur, conflictul īntre mecanismele de virulenţă ale bacteriei şi mecanismele de apărare ale insectei are loc īn hemolimfă. Īn plus, această cale, transcuticulară, de administrare a dozelor bacteriene, este singura care oferă siguranţa realizării acesteia, a inoculării unei doze exacte, a intervalului de timp efectiv a infecţiei, etc.

 

Concluzii

A fost realizată analiza (v.p.m., a.s., c.v., min. şi max.) DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului larvelor, pupelor de diferite stadii şi albibnelor adulte de diferite vārste cu infecţii bacteriene experimentale şi a celor provenite dintr-o familie cu ascosferoză naturală. S-a constatat că agresiunea īn sine (inocularea) este capabilă să inducă creşteri ale GR+OE la adultele de 7-45 zile şi ale CO la larve, că infecţia cu B.(P.) larvae poate induce apariţia la adultele de 0-6 zile a PL4 şi a PL1+PR la pupele cu ochi roz, că infecţia cu B.(P.) alvei poate induce o creştere pronunţată a GR+OE la adultele de 7-45 zile, că infecţia cu E.coli induce modificări ale PL4, GR+OE şi CO, contrare faţă de cele induse de inocularea cu PBS, B.(P.) larvae şi B.(P.) alvei şi că, la subloturile de insecte provenite dintr-o familie cu ascosferoză naturală, modificările PL1+PR, PL2 şi PL3 sunt contrare modificărilor acestor hemocite din subloturile cu infecţii bacteriene şi inoculare cu PBS. Astfel, s-a evidenţiat implicarea profundă a GR+OE, sugerāndu-se implicit implicarea fagocitozei īn aceste infecţii bacteriene experimentale cu excepţia celei cu E. coli, şi probabil īn infecţia clinic inaparentă a insectelor cu A. apis, precum şi implicarea īntr-un mod necunoscut a PL4 īn infecţia cu E.coli şi a PL1+PR şi PL2 īn infecţia cu A. apis.

S-a constatat că, cu cāt numărul de bacterii libere īn hemolimfă este mai mare, cu atāt ift-ul şi ifg-ul sunt mai mari şi, implicit, infecţia este mai intensă şi eficienţa fagocitozei este mai redusă. Astfel, īn infecţiile bacteriene experimentale cu B.(P.) larvae, B.(P.) alvei şi E.coli, fagocitoza este intens implicată īnsă ea pare a fi eficientă numai cānd numărul de bacterii libere / cāmp frotiu este mic. Cānd acest număr depăşeşte cāteva zeci, fagocitoza pare a deveni ineficientă.

Considerăm că aceste rezultate pot fi semnificative şi pentru infecţiile bacteriene naturale, cel puţin pentru larve şi pupe ochi albi şi roz.

 

Mulţumiri d-lui Ing. Stancu G. pentru amabilitatea deosebită de a le pune la dispoziţie albinele (diferite stadii de dezvoltare ontogenetică) provenite din familii sănătoase.

                                       




 

 

Bibliografie

 

1. Alonso J.M., Rey J., Puerta F., de Mendoza J.H., de Mendoza M.H., Flores J.M., 1993. Enzymatic equipment of Ascosphaera apis and the development of infection by this fungus in Apis mellifera. Apidologie, 24 (4), 383-391

2. Bailey L., 1963. Infectious diseases of the honey-bee. Land Books Limited, London.

3. Bailey L., 1981. Patologia albinelor. Buletinul de Informare Stiintifica nr. 7, 1993, LCSVD, Bucuresti. Traducere si prelucrare Dr. Mardare Aneta si Biol. Chioveanu Gabriela, dupa: Bailey L. (1981), Honeybee Pathology, Academic Press, London

4. Casteels P.R., Van Steenkiste D., Jacobs F.J., 1988. The antibacterial response of haemolymph from adult honeybees (Apis mellifera L.) in relation to secondary infections. In: Proc. Meeting E.C. Experts Group: European Research on Varroatosis Control. Bad Hamburg, 105-111

5. Casteels P., Ampe C., Jacobs F., Vaeck M., Tempst P., 1989. Apidaecins: antibacterial peptides from honeybees. The EMBO Journal, 8, (8), 2387-2391

6. Gilliam Martha, 1978. Fungi. In: Roger A. Morse (Ed), Honey bee pests, predators and diseases. Cornell University Press, Ithaca and London, 78-101

7. Gilliam Martha, 1978. Chalkbrood – Status today and hopes for control. American Bee Journal, 118 (7), 468-471

8. Gilliam Martha, Taber S. III, Rose J.B., 1978. Chalkbrood disease of honey bees, Apis mellifera L.: a progress report. Apidologie, 9 (1), 75-89

9. Mārza E., Nicolaide N., 1990. Initiere si practica īn apicultura. Editura de propaganda tehnica agricola, Bucuresti, p. 44

10. Papadopoulou Karabela K., Iliadis N., Liakos V., 1993. Haemocytes changes in honeybee (Apis mellifera L.) artificially infected by Pseudomonas aeruginosa. Apidologie, 24, 81-86

11. Popa Al., 1965. Bolile albinelor si viermilor de matase. Editura Agro-Silvica, Bucuresti, 34-35

12. Sorescu I., Turcu D., 1998. Contribuţii privind hemocitele albinei melifere (Apis mellifera L.): caractere morfologice şi clasificare, multiplicare şi răspāndire īn organism. Studii şi Cercetări de Medicină Veterinară (Institutul Pasteur), 7

13. Van  Steenkiste  D., 1988.  De  hemocyten  van  de  honingbij  (Apis mellifera L.): typologie, bloedbeeld en cellulaire verdedigingsreacties. Doctoraatsproefschrift, Rijksuniversiteit Gent, Belgium

14. Vey A., 1990. Recent researches on ascosphaerosis. In: Proc. Int. Sym. Recent Res. Bee Pathology (Ritter W. ed.), Apimondia, Ghent, Belgium, 40-143

15. Whitcomb R.F., Shapiro M., Granados R., 1974. Insect defense mechanisms against microorganisms and parasitoids. In: The physiology of Insecta, second edition, edited by Rockstein M., vol. V, Academic Press, New York and London, 447-536

16. Wille H., Vecchi Maria A., 1974. Untersuchungen uber die Hamolymphe der Honigbiene  (Apis mellifica L.). Mitteilungen der Schweizerischen Entomologischen Gesellschaft, 47, 133-149

 


Tabelul 1. Numărul de insecte, pentru fiecare sublot de vārstă al lotului II, pentru care DHC-ul a putut fi determinat

 

Larve lucr.

5-7 zile

Larve trāntor.

5-7 zile

Pupe ochi albi

trāntori

Pupe ochi bruni

lucr.

Pupe ochi bruni trāntori.

Pupe ochi bruni şi torace pigm.-ecloz lucrătoare

Adulte lucr vară.

0-6 zile

Adulte lucr vară.

7-45 zile

11

3

1

9

4

7

7

2

 

 

Tabelul 2. Structura lotului III de insecte, īn urma efectuării inoculărilor bacteriene, cu redarea doar a numărului de insecte al căror DHC a putut fi determinat

 

 

Larve lucrăt.

5-7 zile

Pupe ochi albi lucrăt.

Pupe ochi roz lucrăt.

Pupe ochi roz trāntor.

Pupe ochi bruni trāntori

Adulte lucr vară.

7-45 zile

Martor neinoculat

4

5

5

3

-

4

Martor inoculat

cu PBS

3

3

8

-

-

2

B(P.) larvae

PBS

-

-

10

-

-

4

B(P.) larvae

bulion

-

-

-

-

5

-

E. coli

7

6

-

-

-

2

(“-“: nu s-a lucrat)

 

Tabelul 3. Structura lotului IV de albine, īn urma efectuării inoculărilor bacteriene, cu redarea doar a numărului de insecte al căror DHC a putut fi determinat

 

 

Martor neinoculat

Martor inoculat

cu PBS

B.(P.) larvae PBS

B.(P.) larvae bulion

Adulte lucr. de vară, 7-45 zile

6

3

4

3

 

Tabelul 4. Structura lotului V de insecte, īn urma efectuării inoculărilor bacteriene, cu redarea doar a numărului de insecte al căror DHC a putut fi determinat

 

 

Larve lucrăt.

5-7 zile

Pupe ochi bruni lucrăt.

Adulte lucrăt. vară.

0-6 zile

Adulte lucrăt. vară.

7-45 zile

Martor neinoculat

8

6

4

-

B.(P.) larvae PBS

7

7

10

-

B.(P.) alvei

-

14

-

3

B. laterosporus

-

8

-

-

B. circulans

-

12

-

-

(“-“: nu s-a lucrat)

 

Tabelul 5. Analiza DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului pentru subloturile de larve [M.n. = martor neinoculat; L = lucrătoare; tr = trāntori; Asc = ascosferoză; M PBS = martor inoculat cu PBS; N = număr de insecte, valori; a.s. = abaterea standard; c.v. = coeficient de variabilitate; min = valoare minimă; max = valoare maximă;
 “-“ = nu e cazul sau nu are sens; II-V = loturile de insecte; a = 0-25 celule de      B. (P.) larvae libere īn hemolimfă / cāmp frotiu; b = 40-100 celule de E. coli libere īn hemolimfă / cāmp frotiu); PL1+PR = plasmatocit rotund+prohemocit; PL2 = plasmatocit intermediar; PL3 = plasmatocit oval; PL4 = plasmatocit fusiform; GR+OE = granulocit + oenocitoid; CO = coagulocit

 

Nr.crt.

Tip/categ. hemocit, ift,ifg

Ele­men­tele analizei

V

Larve M.n. (L)

III

Larve M.n. (L)

V

Larve B.(P.) larvae PBS (L) a

III

Larve E. coli (L) b

II

Larve Asc. (tr)

II

Larve Asc. (L)

III

Larve M.PBS. (L)

1

PL1+PR

N

8

4

7

7

3

11

3

 

 

medie

0

0

0

0

0

0

0

 

 

a.s.

0

0

0

0

0

0

0

 

 

cv%

-

-

-

-

-

-

-

 

 

min

0

0

0

0

0

0

0

 

 

max

0

0

0

0

0

0

0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

PL2

idem

PL1+PR

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3

PL3

idem

PL1+PR

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4

PL4

idem

PL1+PR

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5

GR+OE

N

8

4

7

7

3

11

3

 

 

medie

98,88

90,25

95,71

94,14

95,67

92,18

82

 

 

a.s.

0,83

5,3

4,5

5,15

3,51

3,57

2

 

 

cv%

1

6

5

5

4

4

2

 

 

min

98

84

90

85

92

86

80

 

 

max

100

97

100

100

99

96

84

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6

CO

N

8

4

7

7

3

11

3

 

 

medie

1,12

9,75

4,29

5,86

4,33

7,82

18

 

 

a.s.

0,83

5,3

4,5

5,15

3,51

3,57

2

 

 

cv%

74

55

105

88

81

46

11

 

 

min

0

3

0

0

1

4

16

 

 

max

2

16

10

15

8

14

20

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7

ift

N

-

-

7

7

-

-

-

 

 

medie

 

 

0,286

0,58

 

 

 

 

 

a.s.

 

 

0,13

0,15

 

 

 

 

 

cv%

 

 

47%

26%

 

 

 

 

 

min

 

 

0,1

0,29

 

 

 

 

 

max

 

 

0,5

0,72

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8

ifg

N

-

-

7

7

-

-

-

 

 

medie

 

 

0,30

0,62

 

 

 

 

 

a.s.

 

 

0,15

0,17

 

 

 

 

 

cv%

 

 

49%

27%

 

 

 

 

 

min

 

 

0,1

0,29

 

 

 

 

 

max

 

 

0,56

0,77

 

 

 

 

Tabelul 6. Analiza DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului pentru subloturile de pupe cu ochi albi (aceeaşi legendă ca la tabelul 5, dar cu următoarele modificări: a = 0-1 celule de E. coli libere īn hemolimfă / cāmp frotiu; b = 100-200 celule de E. coli libere īn hemolimfă / cāmp frotiu)

 

Nr.crt.

Tip/categ. hemocit, ift,ifg

Ele­men­tele analizei

III

Pupe ochi albi M.n. (L)

III

Pupe ochi albi M.PBS. (L)

III

Pupe ochi albi

E. coli (L) a

III

Pupe ochi albi

E. coli (L) b

II

Pupe ochi albi Asc. (tr)

1

PL1+PR

N

5

3

4

2

1

 

 

medie

0

0

0

0

1

 

 

a.s.

0

0

0

0

-

 

 

cv%

-

-

-

-

-

 

 

min

0

0

0

0

1

 

 

max

0

0

0

0

1

 

 

 

 

 

 

 

 

2

PL2

N

5

3

4

2

1

 

 

medie

0

0

0

0

0

 

 

a.s.

0

0

0

0

-

 

 

cv%

-

-

-

-

-

 

 

min

0

0

0

0

0

 

 

max

0

0

0

0

0

 

 

 

 

 

 

 

 

3

PL3

idem

PL2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4

PL4

idem

PL2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5

GR+OE

N

5

3

4

2

1

 

 

medie

93,6

92

93,75

93

98

 

 

a.s.

6,43

2,65

1,89

1,41

-

 

 

cv%

7

3

2

2

-

 

 

min

84

90

91

92

98

 

 

max

100

95

95

94

98

 

 

 

 

 

 

 

 

6

CO

N

5

3

4

2

1

 

 

medie

6,4

8

6,25

7

1

 

 

a.s.

6,43

2,65

1,89

1,41

-

 

 

cv%

100

33

30

20

-

 

 

min

0

5

5

6

1

 

 

max

16

10

9

8

1

 

 

 

 

 

 

 

 

7

ift

N

-

-

4

2

-

 

 

medie

 

 

0,088

0,575

 

 

 

a.s.

 

 

0,025

0,035

 

 

 

cv%

 

 

29

6

 

 

 

min

 

 

0,05

0,55

 

 

 

max

 

 

0,1

0,6

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8

ifg

N

-

-

4

2

-

 

 

medie

 

 

0,098

0,62

 

 

 

a.s.

 

 

0,025

0,028

 

 

 

cv%

 

 

26

5

 

 

 

min

 

 

0,06

0,6

 

 

 

max

 

 

0,11

0,64

 

 

Tabelul 7. Analiza DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului pentru subloturile de pupe cu ochi roz [aceeaşi legendă ca la tabelul 5, dar cu modificările: a = 0-1 celule de B.(P.) larvae libere īn hemolimfă / cāmp frotiu, şi b nu există]

 

Nr.crt.

Tip/categ. hemocit, ift,ifg

Ele­

men­

tele analizei

III

Pupe ochi roz M.n. (L)

III

Pupe ochi roz M.n. (tr)

III

Pupe ochi roz

M.PBS. (L)

III

Pupe ochi roz B.(P)

larvae.

PBS. (L)

a

1

PL1+PR

N

5

3

8

10

 

 

medie

0

1,33

0

0,1

 

 

a.s.

0

1,16

0

0,32

 

 

cv%

-

87

-

316

 

 

min

0

0

0

0

 

 

max

0

2

0

1

 

 

 

 

 

 

 

2

PL2

N

5

3

8

10

 

 

medie

0

0,33

0

0

 

 

a.s.

0

0,57

0

0

 

 

cv%

-

173

-

-

 

 

min

0

0

0

0

 

 

max

0

1

0

0

 

 

 

 

 

 

 

3

PL3

N

5

3

8

10

 

 

medie

0

0

0

0

 

 

a.s.

0

0

0

0

 

 

cv%

-

-

-

-

 

 

min

0

0

0

0

 

 

max

0

0

0

0

 

 

 

 

 

 

 

4

PL4

idem

PL3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5

GR+OE

N

5

3

8

10

 

 

medie

92,8

94

89,37

93,6

 

 

a.s.

8,2

7

6,95

4,4

 

 

cv%

9

7

8

5

 

 

min

84

86

77

86

 

 

max

100

99

95

99

 

 

 

 

 

 

 

6

CO

N

5

3

8

10

 

 

medie

7,2

4,34

10,63

6,3

 

 

a.s.

8,2

6,66

6,95

4,22

 

 

cv%

114

154

65

67

 

 

min

0

0

5

1

 

 

max

16

12

23

13

 

 

 

 

 

 

 

7

ift

N

-

-

-

10

 

 

medie

 

 

 

0,08

 

 

a.s.

 

 

 

0,026

 

 

cv%

 

 

 

32

 

 

min

 

 

 

0,05

 

 

max

 

 

 

0,1

 

 

 

 

 

 

 

8

ifg

N

-

-

-

10

 

 

medie

 

 

 

0,086

 

 

a.s.

 

 

 

0,027

 

 

cv%

 

 

 

32

 

 

min

 

 

 

0,05

 

 

max

 

 

 

0,11

 

Tabelul 8. Analiza DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului pentru 7 subloturi de pupe cu ochi bruni (aceeaşi legendă ca la tabelul 5, dar făr㠓a”, iar b = bacili liberi īn hemolimfă / cāmp frotiu)

 

Nr.

crt.

Tip/categ. hemocit, ift,ifg

Ele­

men­

tele analizei

V

Pupe ochi bruni M.n. (L)

V

Pupe ochi bruni B.circulans (L)0-1b

V

Pupe ochi bruni B.circulans (L)0-10b

V

Pupe ochi bruni B.circulans (L)20-100b

V

Pupe ochi bruni B.

laterosporus

(L)0-8b

V

Pupe ochi bruni B.

laterosporus

 (L) 20-60b

V

Pupe ochi bruni B.

laterosporus

(L)100-150b

1

PL1+PR

N

6

2

1

9

1

6

1

 

 

medie

2,83

40

10

9,89

10

4

0

 

 

a.s.

2,23

28,28

-

9,61

-

6,32

-

 

 

cv%

79

71

-

108

-

158

-

 

 

min

0

20

10

0

10

0

0

 

 

max

6

60

10

30

10

14

0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

PL2

N

6

2

1

9

1

6

1

 

 

medie

0,83

5

0

1,11

5

0

0

 

 

a.s.

0,98

7,07

-

2,42

-

0

-

 

 

cv%

118

141

-

218

-

-

-

 

 

min

0

0

0

0

5

0

0

 

 

max

2

10

0

7

5

0

0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3

PL3

N

6

2

1

9

1

6

1

 

 

medie

0

0

0

0

10

0

0

 

 

a.s.

0

0

-

0

-

0

-

 

 

cv%

-

-

-

-

-

-

-

 

 

min

0

0

0

0

10

0

0

 

 

max

0

0

0

0

10

0

0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4

PL4

N

6

2

1

9

1

6

1

 

 

medie

0

0

0

0

0

0

0

 

 

a.s.

0

0

-

0

-

0

-

 

 

cv%

-

-

-

-

-

-

-

 

 

min

0

0

0

0

0

0

0

 

 

max

0

0

0

0

0

0

0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5

GR+OE

N

6

2

1

9

1

6

1

 

 

medie

89,84

55

90

86,67

75

91

95

 

 

a.s.

2,64

35,36

-

11,63

-

9,17

-

 

 

cv%

3

64

-

13

-

10

-

 

 

min

86

30

90

63

75

75

95

 

 

max

93

80

90

100

75

100

95

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6

CO

N

6

2

1

9

1

6

1

 

 

medie

6,5

0

0

3,33

0

5

5

 

 

a.s.

1,52

0

-

4,39

-

5,51

-

 

 

cv%

23

-

-

132

-

110

-

 

 

min

4

0

0

0

0

0

5

 

 

max

8

0

0

10

0

11

5

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7

ift

N

-

2

1

9

1

6

1

 

 

medie

 

0,06

0,2

0,51

0

0,42

0,8

 

 

a.s.

 

0,06

-

0,20

-

0,19

-

 

 

cv%

 

94

-

40

-

47

-

 

 

min

 

0,02

0,2

0,3

0

0,2

0,8

 

 

max

 

0,1

0,2

0,71

0

0,7

0,8

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8

ifg

N

-

2

1

9

1

6

1

 

 

medie

 

0,1

0,22

0,59

0

0,44

0,84

 

 

a.s.

 

0,4

-

0,22

-

0,17

-

 

 

cv%

 

42

-

37

-

38

-

 

 

min

 

0,07

0,22

0,3

0

0,27

0,84

 

 

max

 

0,13

0,22

0,8

0

0,7

0,84

 

Tabelul 9. Analiza DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului pentru alte 6 subloturi (+ repe­tarea prezentării sublotului martor) de pupe cu ochi bruni [aceeaşi legendă ca la tabelul 5, dar a=0-1 celule de B.(P.) larvae libere īn hemolimfă / cāmp frotiu şi b = bacili liberi īn hemolimfă / cāmp frotiu]

 

Nr.

crt.

Tip/categ. hemocit, ift,ifg

Ele­

men­

tele analizei

V

Pupe ochi bruni M.n. (L)

V

Pupe ochi bruni B.circ. (L)0-1b

V

Pupe ochi bruni B.circ. (L)0-10b

III

Pupe ochi bruni B.circ. (L)

20-100b

II

Pupe ochi bruni

B.later(L)

0-8b

II

Pupe ochi bruni

B.later(L)

20-60b

II

Pupe ochi bruni

B.later(L)

100-150b

1

PL1+PR

N

6

14

7

5

4

9

7

 

 

medie

2,83

4,71

3,57

23,4

1,25

3,11

65,43

 

 

a.s.

2,23

5,3

3,95

7,67

1,89

3,14

18,47

 

 

cv%

79

112

111

33

151

101

28

 

 

min

0

0

0

10

0

0

29

 

 

max

6

15

10

28

4

8

88

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

PL2

N

6

14

7

5

4

9

7

 

 

medie

0,83

1,07

0,71

7,6

0,25

3,22

1,57

 

 

a.s.

0,98

2,43

0,95

5,59

0,5

8,27

3,73

 

 

cv%

118

227

133

74

200

257

238

 

 

min

0

0

0

0

0

0

0

 

 

max

2

8

2

15

1

25

10

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3

PL3

N

6

14

7

5

4

9

7

 

 

medie

0

0

0

1,6

0,25

0

0

 

 

a.s.

0

0

0

1,14

0,5

0

0

 

 

cv%

-

-

-

71

200

-

-

 

 

min

0

0

0

0

0

0

0

 

 

max

0

0

0

3

1

0

0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4

PL4

N

6

14

7

5

4

9

7

 

 

medie

0

0

0

0

0

0

0

 

 

a.s.

0

0

0

0

0

0

0

 

 

cv%

-

-

-

-

-

-

-

 

 

min

0

0

0

0

0

0

0

 

 

max

0

0

0

0

0

0

0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5

GR+OE

N

6

14

7

5

4

9

7

 

 

medie

89,84

85

90,15

57,8

86,5

83

31,14

 

 

a.s.

2,64

5,86

3,34

13,33

10,47

11,3

18,73

 

 

cv%

3

7

4

23

12

14

60

 

 

min

86

75

85

45

77

64

12

 

 

max

93

93

95

80

97

98

68

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6

CO

N

6

14

7

5

4

9

7

 

 

medie

6,5

9,22

5,57

9,6

11,75

10,67

1,86

 

 

a.s.

1,52

3,58

3,91

0,55

8,5

7,09

1,34

 

 

cv%

23

39

70

6

72

66

72

 

 

min

4

2

0

9

3

0

0

 

 

max

8

15

10

10

20

22

4

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7

ift

N

-

14

7

5

-

-

-

 

 

medie

 

0,42

0,07

0,15

 

 

 

 

 

a.s.

 

0,13

0,04

0,061

 

 

 

 

 

cv%

 

32

55

41

 

 

 

 

 

min

 

0,15

0

0,1

 

 

 

 

 

max

 

0,6

0,1

0,25

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8

ifg

N

-

14

7

5

-

-

-

 

 

medie

 

0,49

0,08

0,27

 

 

 

 

 

a.s.

 

0,14

0,05

0,12

 

 

 

 

 

cv%

 

28

56

44

 

 

 

 

 

min

 

0,2

0

0,13

 

 

 

 

 

max

 

0,68

0,12

0,45

 

 

 

 

Tabelul 10. Analiza DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului pentru subloturile de albine adulte de vară īn vārstă de 0-6 zile şi pentru lotul I de albine adulte de iarnă [legenda  este aceeaşi cu cea de la tabelul 5, dar cu următoarele modificări: a = 0-10 celule de B.(P.) larvae libere īn hemolimfă / cāmp frotiu şi b = 11-60 celule de B.(P.) larvae libere īn hemolimfă / cāmp frotiu]

 

Nr.

crt.

Tip/categ. hemocit, ift,ifg

Ele­

men­

tele analizei

I

Adulte iarnă

M.nein.

(150 z) (L)

V

Adulte vară

0-6 zile

M.nein. (L)

V

Adulte vară

0-6 zile

B.(P.) larvae (L) a

V

Adulte vară

0-6 zile

B.(P.) larvae (L) b

II

Adulte vară

0-6 zile

Asc (L)

1

PL1+PR

N

7

4

9

1

7

 

 

medie

4,61

69,25

55

24

73,68

 

 

a.s.

3,41

17,29

12,14

-

10,13

 

 

cv%

74

25

22

-

14

 

 

min

0,84

51

33

24

59

 

 

max

8,7

85

71

24

85

 

 

 

 

 

 

 

 

2

PL2

N

7

4

9

1

7

 

 

medie

6,68

3,5

9,78

5

6,16

 

 

a.s.

5,85

1,29

3,99

-

5,33

 

 

cv%

88

37

41

-

86

 

 

min

0,28

2

5

5

0,8

 

 

max

17

5

16

5

15

 

 

 

 

 

 

 

 

3

PL3

N

7

4

9

1

7

 

 

medie

85,07

9,25

18

10

10,36

 

 

a.s.

10

7,27

7,95

-

4,51

 

 

cv%

12

79

44

-

44

 

 

min

67

2

10

10

5

 

 

max

97,76

16

34

10

16

 

 

 

 

 

 

 

 

4

PL4

N

7

4

9

1

7

 

 

medie

1

0

0,33

0

0,89

 

 

a.s.

0,66

0

0,5

-

1,43

 

 

cv%

66

-

150

-

161

 

 

min

0,4

0

0

0

0

 

 

max

2

0

1

0

4

 

 

 

 

 

 

 

 

5

GR+OE

N

7

4

9

1

7

 

 

medie

1,22

16

16,22

60

7,91

 

 

a.s.

0,77

9,83

5,89

-

8,37

 

 

cv%

63

61

36

-

106

 

 

min

0

7

9

60

2

 

 

max

2

28

25

60

22

 

 

 

 

 

 

 

 

6

CO

N

7

4

9

1

7

 

 

medie

1,42

2

0,67

1

1

 

 

a.s.

2,12

0

0,87

-

1,53

 

 

cv%

149

0

130

-

153

 

 

min

0

2

0

1

0

 

 

max

6

2

2

1

4

 

 

 

 

 

 

 

 

7

ift

N

-

-

9

1

-

 

 

medie

 

 

0,02

0,05

 

 

 

a.s.

 

 

0,02

-

 

 

 

cv%

 

 

78

-

 

 

 

min

 

 

0

0,05

 

 

 

max

 

 

0,05

0,05

 

 

 

 

 

 

 

 

 

8

ifg

N

-

-

9

1

-

 

 

medie

 

 

0,12

0,83

 

 

 

a.s.

 

 

0,1

-

 

 

 

cv%

 

 

84

-

 

 

 

min

 

 

0

0,83

 

 

 

max

 

 

0,33

0,83

 

 

Tabelul 11. Analiza DHC-ului, a ift-ului şi a ifg-ului pentru 7 subloturi de albine adulte de vară īn vārstă de 7-45 zile (aceeaşi legendă ca la tabelul 5, dar: a = 0-5 celule de E. coli libere īn hemolimfă / cāmp frotiu şi b = bacili liberi īn hemolimfă / cāmp frotiu)

 

Nr.

crt.

Tip/categ. hemocit, ift,ifg

Ele­

men­

tele analizei

III

Adulte vară

7-45 zile

M.n. (L)

IV

Adulte vară

7-45 zile

M.n. (L)

III

Adulte vară

7-45 zile

M.PBS. (L)

IV

Adulte vară

7-45 zile

M.PBS. (L)

V

Adulte vară

7-45 zile

B.alvei (L)0-10b

III

Adulte vară

7-45 zile

E.coli (L)a

II

Adulte vară

7-45 zile

Asc (L)a

1

PL1+PR

N

4

5

2

3

3

2

2

 

 

medie

37,3

50,2

24,5

45

20

36

53

 

 

a.s.

10,1

9,25

6,4

0

13

19,8

29,7

 

 

cv%

27

18

26

0

65

55

56

 

 

min

27

37

20

45

12

22

32

 

 

max

48

55

29

45

35

50

74

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2

PL2

N

4

5

2

3

3

2

2

 

 

medie

25,5

11,4

20

7,3

6,67

11,5

9,5